Schneller und spezifischer Nachweis von Pseudomonas aeruginosa

Indikator für Hygiene

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Bei der Überwachung der Wasserqualität in der Pharmaproduktion muss der Nachweis von Bakterien schnell, hochspezifisch und sicher erfolgen. Der Indikatorkeim Pseudomonas aeruginosa beispielsweise gibt Auskunft über die Reinheit und gesundheitliche Unbedenklichkeit des Wassers. Die VIT-Gensondenanalytik ermöglicht einen schnellen und spezifischen Nachweis dieser Mikroorganismen.

Dr. Jiri Snaidr

Wasser ist der wichtigste Rohstoff in der Pharmaindustrie und wird bei der Produktion von Arzneimitteln in verschiedenen Reinheitsstufen eingesetzt. Durch die Aufbereitung von Trinkwasser lassen sich die unterschiedlichen Wasserqualitäten vom Reinwasser bis zu Wasser für Injektionszwecke erreichen. Ein Keim, der im Trinkwasser vorkommt und als Indikator für die Hygiene gilt, ist Pseudomonas aeruginosa. Er kann insbesondere bei Personen mit geschwächten Immunsystemen sowohl chronische als auch akute Infektionen auslösen. Der Keim ist im Gegensatz zu E. coli und Enterokokken im Wasser gut vermehrungsfähig und breitet sich bevorzugt im Bereich von Leitungsendstrecken und an der Wand von Trinkwasserbehältern aus. Das Bakterium ist sehr widerstandsfähig gegen Umwelteinflüsse und kann sich auch bei einem sehr geringen Nährstoffangebot noch vermehren. Da es gegen zahlreiche Desinfektionsmittel resistent ist, ist eine vollständige Eliminierung oft nur schwer zu erreichen.
Konventioneller Nachweis
Konventionelle Methoden zum Nachweis von Pseudomonas aeruginosa arbeiten auf Basis der Kultivierung. Hierbei wird die zu untersuchende Probe auf ein künstliches Nährmedium überführt, das dem einzelnen Bakterium ein Wachstum zu einer sichtbaren Kolonie ermöglichen soll. Auf den recht einfach gehaltenen Nährböden wachsen allerdings lediglich 0,1 bis 1% aller Mikroorganismen. Der Standardnachweis von Pseudomonas aeruginosa benötigt mehrere Tage. Er beruht auf der Kultivierung des Bakteriums und dem Nachweis der Pigmente Pycocyanin, Pyorubin und Fluorescein. Allerdings besitzen nicht alle Pseudomonas aeruginosa-Stämme alle drei Pigmente, so dass für eine zuverlässige Prüfung Bestätigungstest notwendig sind, die auf der Charakterisierung physiologischer Eigenschaften beruhen. Darüber hinaus können verschiedene externe Faktoren den Nachweis empfindlich beeinträchtigen und zu falschen Ergebnissen führen.
Gensondentechnologie
Die als VIT (vermicon identification technology) bezeichnete Gensondenanalytik von vermicon macht sich die Tatsache zunutze, dass die Bakterien einzigartige und unverwechselbare Marker in ihren Zellen besitzen, die typisch für eine einzelne Bakterienart, eine Bakteriengruppe oder für alle Bakterien sind. Diese Bereiche können als Zielstellen für Gensonden verwendet werden. Gensonden sind extrem kleine Stücke der Erbsubstanz, der DNA, die in einem Speziallabor so konstruiert werden, dass sie sich genau an die Zielstelle anlagern. Die Gensonden liegen in milliardenfacher Ausführung in flüssiger Form vor und werden, nachdem sie mit einem Farbstoff gekoppelt wurden, einfach auf die Originalprobe aufgebracht. Sie durchströmen dann sofort die Originalprobe und dringen in die einzelnen Bakterienzellen ein. Finden sie nun in der Zelle die genaue Zielstelle, für die sie programmiert wurden, so heften sie sich daran. Wird die Probe dann unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet, fängt das Bakterium an zu leuchten. Die Vorteile des Verfahrens sind Schnelligkeit, Zuverlässigkeit, höchste Spezifität und die Tatsache, dass die Mikroorganismen direkt in der Probe identifiziert werden.
Da sich die spezifischen Signaturen der einzelnen Pseudomonaden nur sehr geringfügig unterscheiden, wird für den Nachweis von Pseudomonas aeruginosa das Multiple-Probes-Konzept verwendet. Dabei werden für verwandtschaftlich nahe Gruppen spezifische Gensonden entwickelt. Das eigentliche Bakterium, das nachgewiesen werden soll, sollte in beiden Gruppen vorkommen. Kein weiteres Bakterium darf sowohl in der einen als auch in der anderen Gruppe vorkommen. Wird das gewünschte Bakterium mit Gensonden behandelt, die mit unterschiedlichen Farbstoffen markiert sind, so leuchtet es sowohl in der einen als auch in der anderen Farbe. Im Falle von Pseudomonas aeruginosa leuchten die Bakterien bei der Identifizierung unter dem Fluoreszenzmikroskop sowohl in Rot als auch in Grün. Findet der Anwender Bakterien, die entweder nur in Rot oder nur in Grün leuchten, so sind diese Bakterien zwar der Gattung Pseudomonas zugehörig, entsprechen aber nicht der Art Pseudomonas aeruginosa.
Durchführung der Tests
VIT-Pseudomonas basiert auf dem VIT-System, eine Kombination von verschiedenen Lösungen, den programmierten Gensonden und einem handtellergroßen VIT-Reaktor (Abb. 1). Für die Durchführung und die Auswertung der Tests ist kein molekularbiologisches Know-how notwendig. Darüber hinaus können die Tests in den vorhandenen Laboratorien durchgeführt werden. Bei der VIT-Analyse wird ein Tropfen der zu untersuchenden Probe auf einen Objektträger aufgetragen. Nun werden in aufeinanderfolgenden Schritten verschiedene Lösungen zugetropft: Die erste Lösung tötet die Bakterien sofort ab. Die zweite Lösung bereitet die Bakterien derart vor, dass die Gensonden in die Bakterien eindringen können, die Morphologie der Zellen aber nicht verändert wird. Das Auftropfen einer weiteren Lösung sorgt dafür, dass die programmierten Gensonden in die Zellen eindringen und spezifisch in den Zielzellen binden. Nach einer 90-minütigen Inkubation im VIT-Reaktor sorgt das Aufbringen einer Waschlösung für das Entfernen aller nicht spezifisch gebunden Zellen. Wird der Objektträger nun unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht, so beginnen die markierten Zellen zu leuchten und können dadurch vom Anwender einfach und schnell identifiziert werden (Abb. 2). Der Nachweis der Zellen in der Probe benötigt etwa 3 h, die Hands-on-Zeit beträgt für die Durchführung einer Analyse nur 15 min.
Halle A4, Stand 336
Vom Start-up-Unternehmen zum Hersteller
cav Herr Dr. Snaidr, wie entwickelte sich das junge Biotech-Unternehmen vermicon seit seiner Gründung 1997 und was unterscheidet es von anderen Biotech-Firmen?
Dr. Snaidr vermicon konnte sich in den vergangenen viereinhalb Jahren von einem Start-up-Unternehmen zu einem Unternehmen mit einem kompletten Geschäftsystem entwickeln. Wir besitzen nicht nur eine eigene F&E-Abteilung, sondern produzieren auch im Hause und haben eine kompetente Vertriebsmannschaft sowie ein Customer Support Team aufgebaut. Nach einer intensiven Phase der Produktentwicklung konnten wir im Jahr 2001 erfolgreich die ersten Produkte zum Nachweis von Mikroorganismen herausbringen. Im Unterschied zu den meisten anderen Biotech-Firmen sind wir im Diagnostik- und nicht im Pharma-Bereich aufgestellt. Ungewöhnlich ist dabei, dass wir mit unseren Produkten nicht nur einzelne Marktsegmente, sondern ganze Branchen bedienen. So haben wir VIT-Produkte für den Bereich Lebensmittel, Wasser/Trinkwasser, Umwelt/Industrie und Medizin in unserem Portfolio.
cav Welches Finanzierungsmodell wurde bei der Firmengründung gewählt?
Dr. Snaidr In den ersten Jahren wurde vermicon allein aus dem privaten Kapital der Gründer finanziert. Wir haben im Gegensatz zu manch anderen Start-ups von Anfang an Umsätze aus Dienstleistungen generiert. Dies war ein sehr wichtiger Prozess für uns, war er doch Ausdruck unseres Willens zur Selbständigkeit und Unabhängigkeit. Aus diesem Grund haben wir im Jahr 2002 nur Minderheitsbeteiligungen ins Unternehmen genommen, um damit die weitere erfolgreiche Expansion finanzieren zu können. Neben der Henkel KgaA und der tgb konnten wir mit einem sehr erfahrenen Investmentbanker, der unser Business Angel wurde, das Know-how aus dem Finanzbereich ins Unternehmen integrieren.
cav Wie profitiert vermicon von der Partnerschaft mit Henkel?
Dr. Snaidr Henkel ist mehr als nur ein Geldgeber. Das Unternehmen unterstützt uns bei nationalen und globalen Partnerschaften und ist ein Partner in großen Forschungsprojekten. Das hervorragende internationale Renommee von Henkel diente uns bei vielen Kunden als Türöffner.
cav vermicon hat 2001 erfolgreich die VIT-Produktlinie gelauncht. Welche Neu- und Weiterentwicklungen sind für die Zukunft geplant?
Dr. Snaidr Die VIT-Produkte ermöglichen den Nachweis von Bakterien innerhalb weniger Stunden, und das mit großer Präzision. Besonders im Bereich Lebensmittel und dort im Bereich AFG werden wir mit neuen Produkten schon im Jahr 2002 auf dem Markt erscheinen. Wichtig für uns ist aber auch hier der unmittelbare Nutzen für den Anwender.
cav vermicon hat mit Prof. Dr. Amann vom Max-Planck-Institut in Bremen einen Beratervertrag abgeschlossen. Was versprechen Sie sich von der Unterstützung aus Bremen?
Dr. Snaidr Die hochwertige Qualität und den up-to-date Status unserer Produkte auch in Zukunft zu garantieren, das wird der wesentliche Benefit sein, den wir uns durch die intensive Zusammenarbeit mit dem Direktor des Max-Planck-Institutes in Bremen versprechen.
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