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Kontaminationsgefahr aus dem Erdreich

Schnellnachweissystem für Alicyclobazillen
Kontaminationsgefahr aus dem Erdreich

VIT-Alicyclobacillus ermöglicht in einem Analysenschritt den gleichzeitigen Nachweis von Bakterien der Gattung Alicyclobacillus und Alicyclobacillus acidoterrestris in Fruchtsäften und fruchtsafthaltigen Getränken. Das Schnellnachweissystem basiert auf dem spezifischen Eintrag von farbstoffmarkierten Gensonden in ausgewählte Bakterienzellen.

Karin Thelen und Dr. Claudia Beimfohr

Alicyclobazillen sind aerobe acido- und thermophile Sporen bildende Bakterien, deren natürliches Habitat im Erdboden zu finden ist. Lange Zeit wurde diesem Bodenbewohner keine besondere Aufmerksamkeit gewidmet.
Vermehrte Kontaminationen
Diese Einstellung änderte sich erst, als in den letzten Jahren vermehrt in Europa, den USA und Japan Kontaminationen von verschiedenen Fruchtsäften oder fruchtsafthaltigen Getränken mit bislang unbekannten Verderbniserregern auftraten [1,3,6]. Der Produktverderb ging dabei mit Geruchsveränderungen einher, die als medizinisch [8] oder aseptisch [2] beschrieben wurden.
Die Verwunderung war sehr groß, als diese Bakterien als Alicyclobazillen identifiziert wurden. Verschiedene Studien [2] wurden durchgeführt, um zu klären, wie es diese Bakterien schaffen, in den Produktionsprozess zu gelangen und letztendlich Produktschäden hervorzurufen. Schnell war klar, dass sich die Alicyclobazillen bzw. deren Sporen auf der Oberfläche von Fallobst befinden, das mit Erdreich oder Staub in Berührung gekommen ist und sich auf diesem Weg in den Produktionsprozess einschleichen. Nach Aufklärung des Kontaminationsweges stellte sich weiterhin die Frage, warum diese Bakterien erst im letzten Jahrzehnt verstärkt im Bereich alkoholfreier Getränke auftraten, obwohl sie mit großer Wahrscheinlichkeit schon immer auf der Schale von Früchten anzutreffen waren. Die Erklärung hierfür liegt vermutlich in der Optimierung der Wachstumsbedingungen für Alicyclobazillen im Produkt, beispielsweise durch Modifikationen von Produktionsprozessen oder neuartigen Gebindetypen, bei deren Abfüllung keine vollständige Sauerstoffeliminierung möglich ist. Eine weitere Ursache sind die verlängerten Lagerbedingungen bei erhöhten Umgebungstemperaturen, die besonders in den wärmeren Monaten auftreten.
Diese steigende Tendenz von Alicyclobacillus-Kontaminationen wurde auch vor kurzem in einer deutschen Studie [5] zur Untersuchung von Fruchtgetränken aus dem Handel bestätigt: In 17 % aller 53 untersuchten Proben wurden Alicyclobazillen nachgewiesen. Die Meinung vieler Experten [7,8] geht aber noch viel weiter. Sie postulieren, dass die tatsächliche Menge an durch Alicyclobacillus verursachten Kontaminationen ständig unterschätzt wird und das Problem häufig erst durch Kundenreklamationen zu Tage gefördert wird.
Kein standardisierter Nachweis
Eine besondere Erschwernis beim Nachweis von Alicyclobazillen bestand bislang darin, dass noch kein standardisiertes Nachweisverfahren verfügbar war. Weltweit werden unterschiedlichste Selektivmedien – beispielsweise Kartoffel-Dextrose-, K-, BAT-, BAM- oder Orangenserum-Agar – und anschließende Bestätigungsreaktionen zur Identifizierung von Alicyclobazillen eingesetzt. Es ist somit nur unter erschwerten Bedingungen möglich, Analysenergebnisse miteinander zu vergleichen. Für alle diese Verfahren gilt gleichermaßen, dass mit einer sehr langen Analysendauer von 7 bis 14 Tagen gerechnet werden muss. Im Gegensatz dazu forcieren strikte Nulltoleranzrichtlinien bezüglich des Vorhandenseins von Alicyclobazillen beim Fruchtsaftexport in die USA und Japan ein verstärktes Analysenbewusstsein seitens der Industrie. Das heißt: Der Bedarf an einfachen Analysensystemen, die reproduzierbare Daten liefern, steigt.
Farbstoffmarkierte Gensonden
Aus diesem Grund wurde von vermicon das Schnellnachweissystem VIT-Alicyclobacillus entwickelt. Es ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis von Bakterien der Gattung Alicyclobacillus und Alicyclobacillus acidoterrestris in einer Analyse. Das in diesem System zur Anwendung kommende Verfahren basiert auf dem spezifischen Eintrag von farbstoffmarkierten Gensonden in ausgewählte Bakterienzellen. Die Analyse umfasst dabei eine kurze, etwa zwei Tage dauernde Voranreicherung der Saftprobe in doppeltkonzentrierter BAT- bzw. BAM-Bouillon. Anschließend wird das Vorhandensein von Alicyclobazillen über den spezifischen Gensondennachweis überprüft.
VIT-Alicyclobacillus weist nur lebende, also die potenziell produktschädigenden Bakterien nach. Das Prinzip der VIT-Methode (Vermicon Identification Technology) beruht darauf, dass fluoreszenzmarkierte Gensonden, die spezifisch für Alicyclobazillen programmiert wurden, in die morphologisch intakten Bakterien eindringen und dort an ihre speziellen Zielstellen auf dem genetischen Material der Zellen andocken. Das heißt: Wie ein Schlüssel, der nur in das entsprechende Schloss passt, erfolgt die Anbindung der Gensonden an ihre Zielstellen. Daran schließt sich ein Waschschritt an, in dem alle ungebundenen und überflüssigen Gensonden wieder aus den Zellen entfernt werden. Bei der anschließenden Analyse unter einem einfachen Fluoreszenzmikroskop beginnen alle in der Untersuchungsprobe vorhandenen Alicyclobazillen spezifisch zu leuchten: Die Bakterien der Gattung Alicyclobacillus leuchten grün; der am häufigsten auftretende Fruchtsaftschädling Alicyclobacillus acidoterrestris rot und grün.
Halle 5.0, Stand 126
Schrifttum
[1] Baumgart, J., Menje S.: The impact of Alicyclobacillus acidoterrestris on the quality of juices and soft drinks, Fruit Processing, 2000, 7, 251-254
[2] Brown, K.: New microbiological spoilage challenges in aseptics Alicyclobacillus acidoterrestris spoilage in aseptically packed fruit juices. In T. Ohlsson (ed), Advances in aseptic processing and packaging technologies. Proceedings of the International Symposium, Copenhagen, Sept. 11-12 1995, Swedisch Institute for Food Research, Gutenberg, Sweden
[3] Cerny, G., Hennlich, W., Poralla, K.: Fruchsaftverderb durch Bacillen: Isolierung und Charakterisierung des Verderberregers, Zeitschrift für Lebensmitteluntersuchung und Forschung, 1984, 179, 224-227
[4] Lee, S.-Y., Dougherty, R. and Kang D.-H.: Inhibitory effects of high pressure and heat on Alicyclobacillus acidoterrestris spores in apple juice, Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68/8, 4158-4161
[5] Müller, M. und Schulz-Schroeder, G.: Nachweis von acidophilen Sporenbildnern in Fruchtsaftgetränken, Posterbeitrag zum Symposium Lebensmittel – Mittel zum Leben, gemeinsame Veranstaltung der GdCh und DVG, Münster, 8. – 10. April 2002
[6] Splittstoesser, D., Churey, J., and Lee, C.: Growth characteristics of aciduric sporeforming bacilli isolated from fruit juices, Journal of Food Protection, 1994, 57 (12), 1080-1083
[7] Pinhatti, M., Variane, S., Eguchi S. and Manfio G.: Detection of acidothermophilic bacilli in industrialized fruit juices, Fruit Processing, 1997, 9, 350-353
[8] Walls, I., Chuyate, R.: Alicyclobacillus – historical perspective and preliminary characterization study, Dairy Food and Environmental Sanitation, 1998, 18, 1-5
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