Die Fotometrie ist ein optisches Verfahren zur Bestimmung von Stoffkonzentrationen in einer wässrigen Lösung. Die zu messende Substanz geht eine chemische Verbindung mit einer zugesetzten Chemikalie ein und erzeugt so eine spezifische Färbung. Da die resultierende Farbintensität von der Konzentration der Substanz abhängt, lässt sich diese per Lichtmessung durch eine eingebaute Fotozelle genau bestimmen.
Nach dem Lambert-Beer-Gesetz gilt: Wenn eine Substanz mit Licht der Intensität I0 bestrahlt wird, wird ein Teil der Strahlung durch die Moleküle der Substanz absorbiert und eine verbleibende Intensität I reflektiert oder transmittiert.
Durch den Vergleich der gemessenen Lichtabsorption mit der Absorption bei einer bekannten Konzentration der Substanz lässt sich die Konzentration der Substanz in der gemessenen Probe berechnen.
Da fotometrische Messungen bei der für den jeweiligen Substanz-Chemikalien-Komplex charakteristischen Wellenlänge durchgeführt werden müssen, spielt das Spektrum, das von einem Spektralfotometer erzeugt werden kann, eine wichtige Rolle.
Ein Spektralfotometer kann in der Regel einen größeren Wellenlängenbereich als den des sichtbaren Lichts abbilden. So deckt das Spektralfotometer Iris von Hanna Instruments beispielsweise den Bereich von 390 bis 900 nm ab.
Die Bündelung des Lichtstrahls durch Linsen erhöht die Empfindlichkeit. Präzision erreicht man, indem man mit Prisma und Filterrad ein möglichst schmales Wellenlängenfenster auswählt.
Enzym-Testkit für Ethanol
Mit einem Spektralfotometer kann die Bestimmung der Alkoholkonzentration über eine einfache enzymatische Reaktion erfolgen. Generell eignen sich hierzu handelsübliche Enzym-Testkits für Ethanol, etwa das Ethanol-Testkit der Firma Megazyme.
Die enzymatische Reaktion zur Alkoholbestimmung ist notwendig, weil Ethanol selbst im sichtbaren Wellenlängenbereich fotometrisch nicht gemessen werden kann. Es gibt keine Reagenzien, die eine dem Ethanolgehalt entsprechende Färbung erzeugen würden. Man bestimmt den Alkoholgehalt daher indirekt über die enzymatische Umwandlung von NAD+ (Nikotinamin-Ademin-Dinukleotid) zu dessen reduzierter Form NADH in Anwesenheit von Ethanol.
Das Absorptionsspektrum von NAD+ und NADH ist dabei unterschiedlich. Beide Substanzen haben zwar jeweils ein Absorptionsmaximum bei ca. 260 nm, NADH hat jedoch ein weiteres Absorptionsmaximum bei 340 nm, das NAD+ nicht aufweist.
In der Praxis wird Ethanol zu NAD+ gegeben. Dadurch bildet sich NADH, das dann bei einer Wellenlänge von 340 nm photometrisch nachgewiesen werden kann.
Berechnung des Alkoholgehalts
Dabei finden zwei Reaktionen statt. Ethanol und NAD+ reagieren enzymatisch durch die Alkoholdehydrogenase zu Acetaldehyd, NADH und H+. Zudem reagieren Acetylaldehyd, NAD+ und H2O enzymatisch durch die Aldehyddehydrogenase zu Essigsäure, NADH und H+. Das Gleichgewicht der ersten Reaktion liegt dabei fast vollständig auf der linken Seite, weshalb die zweite Reaktion, bei der Acetaldehyd aus dem Reaktionssystem entfernt wird, zwingend notwendig ist. Es sind also zwei Teile NAD+ nötig, um einen Teil Ethanol in NADH umzuwandeln, das heißt, die gebildete Menge an NADH entspricht der doppelten Menge an Ethanol. Die tatsächliche Menge an Ethanol wird daraus durch Division durch zwei berechnet.
Weinproben müssen in der Regel nicht besonders vorbereitet werden. Je nach erwartetem Alkoholgehalt ist es jedoch notwendig, die Proben der Anleitung entsprechend zu verdünnen. Beispielsweise ist für Weine mit zehn bis 15 % Alkoholgehalt eine Verdünnung von 1:1000 und ein Probenvolumen von 0,1 ml erforderlich.
Bei der Messung mit dem Spektralfotometer Iris von Hanna Instruments können die in der Anleitung des Ethanol-Kits angegebenen Methoden und Mengen verwendet werden. Die erhaltene Absorbanz kann in das Kalkulationsprogramm von Megazyme eingetragen und als Ethanol in g/ml oder % w/v ausgegeben werden. Der Eintrag der A1-Werte (Blankwerte für den Nullabgleich) ist mit dem Iris-Gerät nicht nötig, da es die Differenz aus Blank und Probe automatisch bildet. Es reicht, diese Differenz als A2-Wert einzutragen.
Weißen Burgunder untersucht
Hanna Instruments hat die Methode der Ethanolbestimmung in Wein im eigenen Labor durchgeführt. Zum Einsatz kamen das Ethanol-Kit von Megazyme sowie das Spektralfotometer Iris HI810. Dieses Spektralfotometer hat eine eingebaute Wolfram-Halogenlampe, die eine gute, gleichmäßige Lichtqualität über das gesamte Spektrum gewährleistet. Lange Aufwärmzeiten werden dabei mithilfe der integrierten Split-Beam-Technologie vermieden, indem ein Teil des Strahls durch die Probe und der andere Strahlenteil zum Referenzdetektor geht.
Untersucht wurde ein weißer Burgunder aus der Pfalz mit 11,5 % w/v laut Etikettierung. Der Wein wies die typische erwartete Ethanolkonzentration auf, weshalb die in der Anleitung des Enzym-Kits angegebene Verdünnung verwendet werden konnte.
Die Blankprobe für den Nullabgleich wurde wie folgt gemessen: Zunächst wurden
2,10 ml deionisiertes Wasser (~ 25 °C), 200 µl Puffer, 200 µl NAD+-Lösung, 50 µl Aldehyddehydrogenase-Lösung in die Küvette gegeben und durch Schütteln gemischt. Nach einer Wartezeit von zwei Minuten erfolgte die Nullung der Probe durch Drücken der Zero-Taste. Anschließend wurden 20 µL Alkoholdehydrogenase-Suspension zugegeben und die Lösung erneut gemischt. Nach einer Wartezeit von fünf Minuten erfolgte die Messung der Blankprobe.
Die Weinprobe wurde wie folgt gemessen: Zunächst wurden 2,00 ml deionisiertes Wasser (~ 25 °C), 100 µl verdünnte Weinprobe (1:1000), 200 µl Puffer, 200 µl NAD+-Lösung und 50 µl Aldehyddehydrogenase-Lösung in die Küvette gegeben und durch Schütteln gemischt. Nach einer Wartezeit von zwei Minuten erfolgte die Nullung der Probe durch Drücken der Zero-Taste. Anschließend wurden wieder 20 µl Alkoholdehydrogenase-Suspension zugegeben und die Lösung wurde gemischt. Auch die Messung der Probe erfolgte nach einer Wartezeit von fünf Minuten.
Das Ergebnis für die Absorbanz wurde in das bei Megazyme erhältliche Kalkulationsprogramm eingetragen und berechnet. Das Messergebnis für den Alkoholgehalt betrug 11,521 % w/v. Gerundet stimmte dieser Wert mit dem auf dem Etikett ausgewiesenen Alkoholgehalt von 11,5 % überein.
Fazit
Über die spektralfotometrische Untersuchung in Verbindung mit enzymatischen Reagenzienkits lässt sich der Alkoholgehalt von Wein sehr genau bestimmen. Das einfache Verfahren und die gute Verfügbarkeit der Reagenzien ermöglichen eine unkomplizierte und schnelle Untersuchung. Die Spektralfotometrie ist somit eine wertvolle Alternative zu aufwendigeren Destillationsverfahren.
Hanna Instruments Deutschland, Vöhringen
Autorin Dr. Katharina Fejfar
Anwendungsberaterin,
Hanna Instruments Deutschland
Autorin Sabrina Mesters-Wöll
Technische Redakteurin,
Hanna Instruments Deutschland
