Obwohl Säugetierzellen aufwendig und kostenintensiv zu kultivieren sind, greifen Unternehmen für eine Vielzahl an Biopharmazeutika auf sie zurück. Die wichtigsten Säugetierzellen für therapeutische Proteine sind dabei die CHO-Zellen (Chinese Hamster Ovary). Sie werden in der Zellbiologie und Biotechnologie zur industriellen Produktion u.a. von monoklonalen Antikörpern für Therapie- und Diagnosezwecke eingesetzt. Aufgrund gestiegener Kosten für Säugetierzellen sind alle für deren Wachstum negativen Einflüsse so weit wie möglich zu vermeiden. Studien zeigen, dass bis zu 15 % der Zellkulturexperimente falsch interpretiert oder kontaminiert werden. Andere Aspekte, die zu Problemen führen können, sind Nährstoffmangel, Ansammlung von apoptotischen Zellen, Änderungen des pH-Wertes oder genetische Veränderungen. Um dies zu umgehen sowie einen wirtschaftlichen und skalierbaren Produktionsprozess zu erreichen, sind sterile Bedingungen in Bioreaktoren für die CHO-Zellkulturen eine Grundvoraussetzung. Die meisten Informationen über die Wachstumsbedingungen können durch Probenahme und Offline-Messung wichtiger Parameter und der Zellviabilität erhalten werden. Probenahme und Offlinemessungen erhöhen das Risiko für Kontaminationen. Des Weiteren muss qualifiziertes Personal viel Zeit in die Analyse investieren und die Daten werden ausschließlich zu bestimmten Zeiten, in der Regel während der Arbeitszeit, erhoben. Abhilfe schaffen Onlinesensoren, die das Zellwachstum jederzeit erfassen und dadurch alle Ereignisse protokollieren. Die Technische Universität Budapest ist in der Zellkulturtechnologie sehr erfahren und vergleicht die online erfasste Lebendzelldichte mit der etablierten Offline-Methode. Dafür setzen sie den Incyte-Sensor von Hamilton Bonaduz ein.
Lebende Zelldichte in Echtzeit
Der Incyte-Sensor wurde speziell für Anwendungen bei Säugetierzellen, Hefen und dichten, bakteriellen Fermentationen entwickelt und weder Veränderungen des Mediums noch Mikrocarrier oder Zellfragmente beeinflussen das Messergebnis. Dank des Sensors können nicht nur die Lebendzelldichte in Echtzeit gemessen und aktuelle Informationen über kritische Situationen übermittelt werden. Auch ist es möglich, Prozessabweichungen unmittelbar zu erkennen und erforderliche Gegenmaßnahmen vorzunehmen. In ihren Eigenschaften liefert das Monitoring der Lebendzelldichte zum einen nützliche Erkenntnisse, um die Kultivierungsbedingungen optimal gestalten und die Ausbeute steigern zu können. Zusätzlich werden so Informationen über mögliche Veränderungen der Zellphysiologie erfasst.
Jede Fütterung erkennbar
Bevor die Universität mit den vergleichenden Experimenten beginnen konnte, musste vor der Online-Messung für jeden Zelltyp der Zellfaktor ermittelt werden, d. h. die Korrelation zwischen der gemessenen Permittivität und der Zellkonzentration wurde bestimmt. Um die Anzahl der lebenden Zellen bestimmen zu können, wurden sie in einem Offlineverfahren eingefärbt und gezählt. Der erste Offline-Online-Vergleich erfolgte in einem Batchprozess. In der Wachstumsphase zeigten beide Methoden übereinstimmende Werte. Als die Zelldichte zu einem späteren Zeitpunkt höher und die Nährstoffe weniger wurden, ergab die Offlinemessung abweichende und im Vergleich zum Incyte-Sensor weniger präzise Messwerte. Anschließend wurde das Experiment in einem Fed-Batch-Prozess wiederholt. Alle 48 Stunden, beginnend 72 Stunden nach dem Start der Kultur, wurden bei jeder Fütterung 15 % des Volumens hinzugegeben. Die Wachstumskurve zeigte, dass jede Nährstoffzugabe unmittelbar von Incyte erkannt wurde, denn die Permittivität sank kurzfristig aufgrund eines Verdünnungseffektes der Zelle. Insbesondere das einfache Erkennen der Verdünnung im Fed-Batch-Prozess wurde von den Forschern gelobt und gleichzeitig konstatiert, dass die Offline- und Onlinewerte während der Wachstumsphase der Zellen zwar korrelieren, die Offlineergebnisse aber stark vom Zeitpunkt der Probeentnahme bzw. der Zellzahl abhängen.
Gesteigerte Effektivität
Unabhängig von der Prozessart korrelieren die Methoden in der Wachstumsphase. Mit fortschreitender Dauer der Kultivierung nimmt die Anzahl der Zellfragmente und toter Zellen zu. Dies wirkt sich auf die Offline-Messung aus, sodass es schwieriger ist, die Daten richtig auszuwerten. Im Gegensatz dazu wurde Incyte durch die relativ hohe Anzahl an toten Zellen oder Zellfragmenten nicht beeinflusst. Je länger der Prozess dauerte, desto mehr wichen die gemessenen Werte voneinander ab. Dies liegt darin begründet, dass der Offlinemethode mehr Aufmerksamkeit geschenkt werden muss und es schwieriger ist, die Proben zeitnah im Labor auszuwerten. Der Onlinesensor Incyte hingegen zeichnet alle Werte unmittelbar auf, was Abweichungen direkt identifiziert und einen Eingriff in Echtzeit ermöglicht. Dank der exakten Werte kann die Wachstumsphase verlängert und die Fütterungsstrategie optimiert werden. Zusammengefasst führt dies nicht nur zu einer zuverlässigeren und komfortableren Produktion, sondern auch zu einem höheren Ertrag sowie einer gesteigerten Effizienz.
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Autor: Dr. Knut Georgy
Senior Market Segment Manager Process Analytics,
Hamilton Bonaduz
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