Schnelle Regelstrecken

Die hohe Scherempfindlichkeit von tierischen und pflanzlichen Zellen führte zu wesentlichen Veränderungen im Anlagenbau gegenüber Bakterienfermentern. Da die Gasversorgung von Zellen sowohl von der Belüftung, als auch von der Durchmischung abhängt, müssen beide Systeme speziell für die Zellkultur adaptiert werden.

Adhärente Zellen werden auf Microcarriern direkt im Reaktor oder in einem Festbett gezüchtet und sind dadurch Scherkräften nicht unmittelbar ausgesetzt. Die mechanische Scherbelastung, die auf nicht adhärente Zellen in Submerskultur wirkt, kann durch Propellerrührsysteme, die eine schonendere Durchmischung als herkömmliche Scheibenrührer erzeugen, oder durch Airliftreaktoren, bei denen die Durchmischung nur über die Belüftung erfolgt, verringert werden.

Empfindliche Zellen werden jedoch nicht nur durch Rührwerke, sondern auch durch zerplatzende Gasblasen und Schaum beschädigt. Die einfachste Möglichkeit, die Zellen vor Blasen und Schaum zu schützen ist die Zugabe von Antischaummitteln zum Medium. Diese chemischen Substanzen sind jedoch für viele Zellarten ungeeignet, da sie das Wachstum bzw. für die Fermentation essentielle Stoffwechselvorgänge negativ beeinflussen oder bei der Aufarbeitung des Produkts störend wirken. Deshalb wurden für die Begasung von Zellkulturen spezielle Spargersysteme entwickelt. Sie erzeugen Gasblasen, die möglichst geringe Scherkräfte auf die Zellen ausüben. Bei besonders empfindlichen Zellen kann die Begasung blasenfrei über gaspermeable Schläuche erfolgen.

Nicht nur das Design des Begasungssystems, sondern auch die Gaszusammensetzung sind für Zellkulturen oft von entscheidender Bedeutung. Besonders bei Pflanzenzellen wird schon bei geringen Veränderungen der Gaszusammensetzung der Metabolismus und somit das Wachstumsverhalten und die Produktion der sekundären Metaboliten verändert. Die Begasung mit Sauerstoff-angereicherter Luft führt bei vielen tierischen Zellen zu besseren Produktionsergebnissen.

Daher wird bei Zellkulturen im Gegensatz zu Bakterienkulturen nicht nur mit Luft, sondern mit Sauerstoff, Stickstoff, CO2 und Luft in einer für die jeweilige Zellart und Fermentation optimierten Zusammensetzung begast. Mit genauer Überwachung der Gaszusammensetzung durch empfindliche Regelsysteme wird eine für die Fermentation und die Erzeugung des Produkts optimale Gasatmosphäre geschaffen und konstant gehalten. Während des Zellwachstums ändert sich der pH-Wert im Medium. Für viele Produktionsprozesse ist jedoch ein konstanter pH-Wert essentiell. Dieser muss daher auch geregelt werden. Die Regelung wird zumeist nicht mit Säure- und Basenzugabe wie bei der Bakterienfermentation durchgeführt, sondern über kontrollierte Begasung mit CO2.

Die Zufuhr der vier für die Zellkultur benötigten Gase erfolgt üblicherweise über eine Gasmischstation. In diesem Gerät wird die Dosierung von jedem Gas mit einem Gasflussregler individuell geregelt. Zusätzlich beeinflusst der pH-Regler die CO2-Dosierung. Ein pO2-Regler steuert die Luft- bzw. Sauerstoff- und die Stickstoffzufuhr. Somit wäre die optimale Gasversorgung der Zellen zu jedem Zeitpunkt der Fermentation gewährleistet.

Wegen der hohen Kontaminationsgefahr aufgrund des langsamen Wachstums und der langen Fermentationszeiten müssen in der Zellkulturtechnik absolut sterile Bedingungen aufrechterhalten werden. Dies gilt auch für die Gaszufuhr. Die benötigten Gase müssen nicht nur frei von Mikroorganismen und Viren sein, sondern dürfen auch keine Schmutzpartikel und Öltröpfchen enthalten.

In kleinen autoklavierbaren Fermentern werden zumeist autoklavierbare Einwegfilter mit hydrophober PTFE-Membran zur Sterilisation der Gase und der Abluft verwendet. Diese werden gemeinsam mit dem Fermenter autoklaviert. In situ sterilisierbare Kleinfermenter und größere Anlagen bedienen sich in Gehäusen integrierter Filterkerzen zur Gewährleistung eines sterilen Gasflusses. Es werden entweder Tiefenfilter mit PTFE-veredeltem Mikrofaservlies oder Membranfilter mit synthetischer PTFE-Membrane verwendet. Die Filter und Filtergehäuse werden je nach Reaktordesign entweder direkt mit dem Kessel oder separat in einer genau definierten Sequenz mit Dampf sterilisiert.

Die Sauerstoffkonzentration in Flüssigmedien hängt von der Menge an im Medium gelösten Sauerstoff, von der Sauerstoffmenge in Gasraum oberhalb des Mediums und von der Menge an Gasblasen im Medium ab.

Aufgrund der geringen Wachstumsraten ist auch der Sauerstoffbedarf von Zellkulturen wesentlich geringer als jener von Bakterienkulturen. Daher können die Sauerstoff-Transferraten (OTR) im Reaktor gering sein. Dies erlaubt geringe Rührgeschwindigkeiten und geringe Belüftungsraten. Die Scherbelastung der Zellen wird somit minimiert.

Dennoch kann die Regelung der Gaszusammensetzung bei vielen Zellfermentationen noch nicht in zufriedenstellender Weise bewerkstelligt werden.

Bei hohen Gasflüssen und starker Durchmischung, wie sie bei der Bakterienfermentation üblich sind, spielt die Länge des Weges, den die Gase vom Gasversorger bis zum Kessel zurückzulegen haben, praktisch keine Rolle. Die Gase verteilen sich durch den Eingangsdruck und die effiziente Rührung und gelangen somit schnell zu den Zellen. Bei den schwächer belüfteten und weniger durchrührten Zellkulturen ist die rasche Versorgung nicht unbedingt zu jedem Zeitpunkt gewährleistet.

Tierische und pflanzliche Zellen benötigen jedoch eine genau definierte Gasatmosphäre und einen stabilen pH-Wert in stärkerem Ausmaß als Mikroorganismen. Daher ist eine schnelle Reaktion der Regelung auf Veränderungen dieser Parameter während der Fermentation nicht nur wünschenswert, sondern auch notwendig.

Lange Wege der Gase und relativ lange Verweilzeiten in großen Filtergehäusen können bei vielen Zellkulturen sowohl die pH-Regelung als auch jene des pO2-Werts verzögern und so zu qualitativen Einbußen bei Zellwachstum oder Produktivität führen. Um diesen Effekten entgegenzuwirken, müssen im Wesentlichen drei Maßnahmen getroffen werden: Verkürzung der Abstände zwischen Gasmischstation und Reaktor, Verringerung der Rohrdurchmesser und Verkleinerung des Totvolumens von Filtern und Filtergehäusen. Während die ersten beiden Änderungen im Design, von der Geometrie der Anlage abhängig, relativ unproblematisch durchführbar sind, gestaltet sich die Adaptierung der Filter als schwieriger. Den geringsten Tot-raum und somit auch den kürzesten Weg für durchströmende Gase weisen die bei autoklavierbaren Fermentern verwendeten Einwegfilter auf. Diese können jedoch nicht mit in situ sterilisierbaren Fermentern mitsterilisiert werden und konnten deshalb bisher nicht fest in die Anlage integriert werden. Werden diese Filter separat autoklaviert und nach der Sterilisation des Reaktors in die Anlage eingebaut, entsteht durch diese Manipulation eine Kontaminationsquelle.

Die von Bioengineering entwickelte Lösung basiert auf der Verwendung von tot-raumoptimierten Einwegfiltern mit hydrophober PTFE-Membran auch für in situ sterilisierbare Systeme. Dies minimiert die Verweilzeit der Gase in den Filtern. Eine Verzögerung der Gaszufuhr während der Passage von Filtergehäusen entfällt, da das Belüftungssystem gänzlich auf zusätzliche Gehäuse verzichten kann. Durch die geringere Größe der Filter können die Rohrdurchmesser der Begasungsleitungen gering und die Belüftungsstrecken kurz gehalten werden.

Aber wie kann die Inkompatibilität von autoklavierbaren Einwegfiltern mit in situ sterilisierbaren Fermentern umgangen und gleichzeitig die volle Integration der Filter in die Anlage gewährleistet werden?

In dem Zuluftfiltersystem von Bioengineering befinden sich die Einwegfilter für jedes der vier Gase aus der Gasmischstation in einem mit Sichtfenster ausgestatteten Autoklaven. Dieser Autoklav ist in das Rohrleitungssystem der Anlage integriert. Eine Spezialventilbatterie, die durchlässig für den Autoklavendampf ist, wird im Autoklaven montiert. Der Autoklavendampf sterilisiert die Zuluftstrecke bis zu einem in der Rohrleitung eingebauten getakteten Ventil des Sterilkreuzes. Anschließend wird im Zuge der Fermentersterilisation die Strecke vom Kessel bis zum Sterilkreuz sterilisiert. Eventuell im Rohr eingeklemmte Luft wird somit entfernt. Die Einwegfilter werden im Autoklaven vollautomatisch autoklaviert. Damit ist die volle Integration des Autoklaven und der Filter in der Anlage gewährleistet. Die automatische Sterilisation der Anlage inklusive Einwegfilter wird ermöglicht. Jede Manipulation der Einwegfilter nach der Sterilisation der Anlage entfällt. Dies minimiert das Kontaminationsrisiko und schafft Konformität mit behördlichen Bestimmungen.

Die Vorteile dieses Systems sind evident: nicht nur Zellkulturen in kleinen Benchtop-Fermentern, sondern auch jene in wesentlich größeren Systemen können auf kürzestem Weg mit den benötigten Gasen steril versorgt werden. Dies schafft schnelle Regelstrecken für die pO2- und die pH-Regelung und somit eine effiziente Reaktion auf jede Veränderung im Metabolismus der Zellen während der Fermentation. Die Integration und Automatisierbarkeit des Begasungssystems verringert den Arbeitsaufwand mit Einwegfiltern erheblich und schafft die gleiche Sicherheit, die mit großen Filtern und Filtergehäusen Standard ist.

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Bioengineering AG – Online Lexikon

TechnoPharm 2007