Zur Filtration und Konzentration

Walter R. Pupa, Michael Lyko, Dr. Hans-Dieter Saier

Das Filterprogramm von Microdyn umfasst Module mit Membranflächen von wenigen cm² bis 25 m². Alle Membranen sind rohrförmig in verschiedenen Durchmessern erhältlich. Für die Mikrofiltration werden Membranen aus Polypropylen (PP) und Polyethylen (PE) mit Membraninnendurchmessern von 0,6 , 1,8 und 5,5 mm bei einer Porengröße von 1,0, 0,2 oder 0,1 µm verwendet. Für die Dialyse stehen Hohlfasern aus regenerierter Cellulose (RC) mit einem Membraninnendurchmesser von 0,2 mm und einer Trenngrenze von 10 oder 50 kDalton zur Verfügung.

Die Module übernehmen wichtige Produktionsschritte in validierbaren Anlagen der pharmazeutischen Industrie. Die Produktion von Zellen und Zellprodukten stützt sich dabei auf die Hohlfasertechnologie, die große Flächen in einem kleinen Volumen zur Verfügung stellen kann. Dadurch lassen sich hohe Ausbeuten erzielen. So wurden Zellkonzentrationen von 108 Zellen/ml auch über einen Zeitraum von drei Monaten im kontinuierlichen Einsatz erreicht.

Microdyn ist auf dem Gebiet der industriell angewandten Cross-Flow-Mikrofiltration (CMF), auch als Tangentialflussfiltration (TFF) bekannt, tätig. Bei dieser Form der Filtration wird durch die Überströmung der Membran die Ablagerung von Feststoffen und Kolloiden vermindert. Der verringerte Filterkuchenaufbau lässt dementsprechend einen deutlich erhöhten Filtratfluss zu. Das Membranmaterial Accurel wird auch als Flachmembran weltweit in sogenannten Dead-End-Filterkerzen eingesetzt. Die hier gewonnenen Erfahrungen können für die im Bereich der pharmazeutischen Industrie so wichtige Validierung genutzt werden. Dabei kommen für diesen Bereich häufig dampfsterilisierbare auswechselbare Kerzen in Frage. Die Dead-End-Filtration kann wirtschaftlich nur bei geringen Konzentrationen an abzutrennenden Stoffen eingesetzt werden. Aufgrund der dauerhaft höheren Filtratflüsse kann die Cross-Flow-Filtration auch dann verwandt werden, wenn eine statische Filtration nicht wirtschaftlich ist. Der gleiche Batch kann also mit kleinerer Filterfläche abgearbeitet werden.

Die Hauptanwendungen liegen im Bereich von Zellkonzentrierungen und Zellrecycling. Die Filtrationsdrücke sind in diesen Anwendungen möglichst niedrig zu halten. Dies ist auch sehr produktschonend. Bei der Anwendungsentwicklung werden zuerst Versuche mit kleinen Labormodulen (der Type LM) mit Polycarbonatgehäusen durchgeführt. Diese ermöglichen auch die visuelle Begutachtung des Versuches. Die Größe der zu filtrierenden Batches liegt üblicherweise zwischen wenigen Millilitern und 5 l.

Für die folgenden Pilotversuche mit Ansätzen von 25 bis 50 l wurden MD020-Module mit Polypropylengehäusen eingesetzt. Diese Module haben die gleiche aktive Membranlänge, wie sie später auch in der Produktionsanlage eingesetzt wird.

Die Module der MD070-Serie (Abb.1) für Produktionsanlagen besitzen ein Edelstahlgehäuse, um auch hierdurch die hohen Anforderungen in Bezug auf Sterilität und Validierbarkeit erfüllen zu können. Für die Validierung stehen entsprechende Zertifikate zur Verfügung.

Ein Applikationsbeispiel aus dem Pharmabereich ist die Herstellung von Tissue Plasminogen Aktivator (TPA). TPA wird bei akutem Herzinfarkt zur körpereigenen Aktivierung von Blutgerinsel auflösenden Stoffen eingesetzt. Zur industriellen Herstellung werden dafür hybridisierte Zellen verwendet, deren ausgeschiedene Proteine von der Zellmasse abgetrennt werden müssen.

Bei der Anwendung konventioneller Methoden treten Probleme auf hinsichtlich der Reinheit, der Kapazität und/oder dem Verlust an aktiven Stoffen. Auch ist das Scale-up schwierig durchzuführen.

Die Firma Genentech in Kalifornien hat deshalb seit Ende der 80er Jahre verschiedene Verfahren erprobt und schließlich die CMF mit Microdyn-Membranen ausgewählt. Nach Abschluss der intensiven Vorversuche mit MD070-Kerzen wurde eine industrielle Anlage mit insgesamt 158 m² Membranfläche installiert. Sechs Gehäuse mit jeweils 12 Patronen sind parallel angeordnet. Im Gehäuse sind jeweils zwei Kerzen in Serie. Jede Austauschpatrone weist eine wirksame Membranoberfläche von 2,2 m² auf.

Die Module enthalten Kapillarmembranen aus Accurel-Polypropylen mit einem Kapillarinnendurchmesser von 0,6 mm und Poren von 0,2 mm. Diese Porengröße trennt Zellen (pseudomonas diminuta) mit einem LRV-Wert von 7 ab. Damit ist nach menschlichem Ermessen eine vollständige Abtrennung der hybridisierten Zellen vom Filtrat auch über lange Filtrationszeiten gewährleistet. Dies wurde durch die Messungen bei Pharmafirmen bestätigt. Ermöglicht wird die vollständige Abtrennung durch die spezielle Struktur der Accurel-Membran, die ein Durchwachsen von Zellen verhindert.

Die Gesamtanlage mit 158 m² Membranfläche liefert durchschnittlich 4800 l/h entsprechend einer mittleren spezifischen Leistung von ca. 30 l/m² h und konzentriert dabei die Zellmasse auf das 15-fache auf. Die Adsorption von Proteinen ist vernachlässigbar gering.

Die Druckdifferenz bleibt während der Aufkonzentrierung gleichbleibend niedrig und steigt erst kurz vor Erreichen der 15-fachen Aufkonzentrierung an. Die Abscheidequalität ist dabei unabhängig von der Aufkonzentrierung.

Die CIP-Reinigung der Module erfolgt mit üblichen in der Pharmaindustrie verwendeten Reinigungsmitteln, die eine vollständige Wiederherstellung der Filtrationsleistung ergibt. Ein Kostenvergleich mit einer Dead-End-Filtration ergab, dass bereits bei 20-maliger Benutzung der Austauschpatronen von Microdyn der CMF-Betrieb kostengünstiger ist. Die Kerzen werden bis zu 100 mal benutzt, so dass sich hier ein erheblicher Kostenvorteil ergibt.

Ein weiteres Beispiel ist die Herstellung von Vakzinen. Bei der Herstellung einer 3-fach Kombinationsvakzine verwendet eine amerikanische Pharmafirma ebenfalls die Cross-Flow Mikrofiltration mit Accurel-Membranen aus Polypropylen.

Die Anlage aus Edelstahl besteht aus einem Fermentationsbehälter, der von einem Mikroprozessor gesteuert wird und der Filtrationseinheit aus zwei parallel angeströmten Filtrationsmodulen. Die Module und die mediumberührten Teile werden zuvor 30 min. dampfsterilisiert bei 121 °C.

Anschließend wird die Nährlösung für das Wachstum der Zellen mit einer Leistung von ca. 100 l/m² h bei 0,5 bar Differenzdruck in den Fermenter filtriert. Nach dem Beimpfen des Behälters können die Zellen bis zur gewünschten Zellmasse anwachsen. Nach Abschluss des Zellwachstumsprozesses werden die Zellen von den Proteinen mit denselben Filtermodulen abgetrennt (0,1 µm Porenweite).

Vorteilhaft ist auch hier der sehr geringe Verlust an Proteinen und der weitgehend konstante Fluss über die Filtrationszeit. Damit ist eine schnelle weitere Bearbeitung der Fermenterbrühe möglich.

Weitere Anwendungen für die symmetrischen Accurel-Mikrofiltrationsmembranen sind die Sterilfiltration von Ansatzmedien, die Aufkonzentrierung von Zellsuspensionen, die Gewinnung von extrazellulären Produkten und die Ernährung von Zellen zur Antikörperproduktion (Abb. 2) und viele andere Fest-Flüssig-Trennaufgaben.

Das der Dialyse zugrunde liegende Prinzip ist der durch das Konzentrationsgefälle getriebene Stoffaustausch. Das zu dialysierende Medium fließt in der Regel im Inneren der Hohlfasern. Das Dialysat (aufnehmendes Medium) fließt an der Außenseite der Membran im Gegenstrom, um eine möglichst große Konzentrationsdifferenz zu erreichen.

Die Module sind sowohl als eine Einheit von vergossenen Hohlfasern mit Gehäuse, als auch als auswechselbare Einschubpatronen mit separatem Gehäuse erhältlich. Patronen können auch direkt in Fermentern eingesetzt werden. Bringt man Zellen auf die Außenseite der Membran auf und unterbindet den Dialysatfluss, so erhält man in Kombination mit einem Fermenter einen Perfusions-Bioreaktor.

Generell kann die Dialyse in der pharmazeutischen Industrie und in der Biotechnologie zur Dosierung, Trennung und zum Stoffaustausch eingesetzt werden (Abb. 3) – Aufgaben also, die Membranen auch in der Natur übernehmen.

Die Anwendungen im Einzelnen sind:

• Dosierung von Nährstoffen, Gasen (O2-Zufuhr und CO2-Entfernung) und Edukten

• Entfernung von biologischen oder festen Kontaminationen

• Abtrennung von biologischen Komponenten aus dem Stoffstrom

• Abtrennung von mikroorganischen Produkten, Zellen oder Zellfragmenten

• Austausch und Entfernung von Produkten mit geringem Molekulargewicht

• Stoffaustausch für immobilisierte Enzyme, Mikroorganismen und tierische Zellen