Schnell und schonend

Abb. 1 Homogenisiermaschine für den mechanischen Zellaufschluss bis 1500 bar

Abb. 2 Produktfluss im Hochdruckhomogenisator

Abb. 3 Schnitt durch das Aufschlussventil (Homogenisierventil)

Abb. 4 Aufschlussverhalten unterschiedlicher Einzellersuspensionen

Von den bekannten mechanischen Methoden zum Aufschluss aufkonzentrierter Zellsuspensionen ist das Verfahren mit dem Hochdruckhomogenisator von besonderer Bedeutung. Hierbei sind keine zusätzlichen Hilfsstoffe zum Öffnen der Zellen erforderlich. Auch die kurze Aufschlusszeit mit Vor- und Nachkühlung erlaubt die schonende Behandlung temperaturempfindlicher Suspensionen.

Viele neue pharmazeutische Wirkstoffe lassen sich aus intrazellulären Bestandteilen von Einzellern herstellen. Das betrifft insbesondere Proteine, Enzyme und Zellkernbestandteile. Ein wichtiger Teilschritt zur Gewinnung dieser Materialien ist neben der Herführung, Aufkonzentrierung und Trennung der Aufschlussprozess. Prinzipiell gibt es viele mechanische und lysische Möglichkeiten zum Aufschluss der Einzeller, wobei sich der mechanische Aufschluss mit Hilfe der Hochdruckentspannung als besonders vorteilhaft erwiesen hat, da bei diesem Verfahren die Aufschlussdauer sehr kurz ist und die Temperaturführung optimal gestaltet werden kann.

Die konzentrierte Zellsuspension wird durch eine Hochdruck-Kolbenpumpe auf einen Druck zwischen 700 und 1500 bar verdichtet und in einem Präzisions-Ringspaltventil (Aufschlussventil) wieder auf Atmosphärendruck entspannt. Abbildung 2 zeigt den Produktfluss durch den produktberührten Teil eines Hochdruckhomogenisators, der speziell für den Hochdruckaufschluss von Einzellersuspensionen entwickelt wurde.

Das Aufschlussventil ist einstellbar und ermöglicht die Aufschlussdruckeinstellung unabhängig vom Durchsatz. Darüber hinaus bieten diese Ventile im Gegensatz zu festen Düsen ein hohes Maß an Sicherheit bezüglich Blockierungen, da die Spalthöhe des Ventils für die Konstanthaltung des Aufschlussdruckes variiert wird.

Abbildung 3 zeigt eine schematische Darstellung des Aufschlussventils. In der Homogenisierzone findet der kinetische Energieeintrag in die Zellsuspension statt, die den gewünschten Aufschluss bewirkt.

Die Gestaltung der Ventilteile ist für den Aufschlussgrad entscheidend. Für die Optimierung des Aufschlussgrades sowie für das Scale-up des Prozesses ist die Kenntnis der hydrodynamischen Zusammenhänge im Aufschlussventil von fundamentaler Bedeutung.

Für den Aufschluss aufkonzentrierter Einzeller ist die Kombination aus Kavitation und Turbulenz erforderlich. Das RNS-Aufschlussventil ist im Gegensatz zu normalen Homogenisierventilen so gestaltet, dass die Kavitation möglichst im hinteren Teil der Homogenisierzone stattfindet. Zur Ausbildung der räumlich eng bemessenen Homogenisierzone des RNS-Ventils erfolgt eine starke Beschleunigung im Spalteintritt, die den statischen Druck im Ventilspalt unterhalb des Dampfdruckes der kontinuierlichen Phase ermöglicht. Unter diesen Bedingungen entstehen Dampfblasen an den Grenzflächen zwischen Zelle und Serum (Kavitationskeime). Im hinteren Teil der Homogenisierzone erfolgen die Verdichtungsstöße durch implodierende Dampfblasen, die eine hohe kinetische Energie an die Zellwände abgeben und diese punktuell aufbrechen.

Diese kinetische Energie bewirkt neben dem Aufbruch der Zellwände eine Temperaturerhöhung der Suspension. Die Erhöhung ist vom Arbeitsdruck und von Produkteigenschaften wie beispielsweise Dichte, Gasgehalt und spezifische Wärmekapazität abhängig und muss sowohl bei der Wahl der Eintrittstemperatur, als auch zur Auslegung der Kühlsysteme unbedingt beachtet werden, um unerwünschte Denaturierungen zu unterbinden.

Der Aufschluss von Zellsuspensionen mit Hochdruckhomogenisatoren erfolgt in einer extrem geringen Zeit im Aufschlussventil. Die übliche Zeitdauer liegt unter 100 Mikrosekunden. Gleichzeitig werden dabei sehr hohe Energiedichten realisiert. Ein Durchgang durch einen Hochdruckhomogenisator ist als einzelner Aufschlussschritt aufzufassen und meist ausreichend, um den gewünschten Aufschlussgrad zu erreichen. Zwei oder mehrere Aufschlussschritte führen aufgrund der Statistik zu höheren Aufschlussgraden, aber in Einzelfällen auch zur Veränderung von bereits aufgeschlossenen Materialien, die sich dann schwieriger abzentrifugieren lassen. Diese Effekte sind bereits in der Verfahrensentwicklung im Labor zu berücksichtigen und auszutesten.

Die klassischen Medien für den mechanischen Zellaufschluss sind E.coli und Hefesuspensionen (z.B. Sacc. cerevisiae), die es inzwischen in vielen Modifikationen gibt. Sie zeigen trotz verschiedener Absolutwerte ein ähnliches Aufschlussverhalten. Für bestimmte Spezies gibt es eine untere Druckgrenze, die erst überschritten werden muss, um überhaupt einen messbaren Aufschluss zu erzielen. Für Hefen beträgt diese Grenze etwa 200 bar. Die Beschaffenheit und Festigkeit der Zellwand und die Form der Zelle sind im Gegensatz zu seiner Größe für den erreichbaren Aufschlussgrad von entscheidender Bedeutung (Abb. 4).

Es ist bekannt, dass die Zellkonzentration keinen wesentlichen Einfluss auf den Aufschlussgrad im Hochdruckhomogenisator hat. In der Praxis werden daher möglichst hohe Zellkonzentrationen bevorzugt. Dabei ist jedoch die Viskosität der Zellsuspension insbesondere nach dem Aufschluss zu beachten, die sich bei hoher Zellkonzentration negativ auf den Trenngrad des Separators auswirkt und auch das Fließverhalten verändert.

Der Aufschlussdruck ist der wichtigste Parameter für den Aufschlussgrad. Die Höhe des Aufschlussdruckes muss so bemessen sein, dass einerseits ein wirtschaftlicher Aufschlussgrad erzielt wird, andererseits das aufgeschlossene Material möglicht in nativer Form verbleibt und die Bestandteile separierbar bleiben. Ein vollständiger Aufschluss mit 100% ist auch durch den Einsatz von effizienten Aufschlussventilen und sehr hohem Aufschlussdruck nicht möglich. Im Allgemeinen sind mit sehr hohem Aufschlussdruck aufgeschlossene Zellsuspensionen mechanisch schlecht separierbar.

Um Denaturierungen der empfindlichen intrazellulären Bestandteile zu vermeiden, wird überwiegend bei Homogenisiertemperaturen zwischen 0 °C und 12 °C gearbeitet, um den Anstieg der Temperatur über die Denaturierungsgrenze hinter dem Homogenisierventil zu vermeiden. Bei der Verfahrensentwicklung im Labor ist bezüglich des Temperaturverlaufes darauf zu achten, dass dieser durch geeignete Kühlmaßnahmen auch auf den Produktionsmaßstab übertragen werden kann. Dabei sollte unbedingt die theoretisch ermittelte Temperaturerhöhung (adiabater Fall) durch den Aufschluss berücksichtigt werden, da die praktischen Laborwerte deutlich niedriger liegen.

Elektrolyte beeinflussen den osmotischen Druck der Lösung. Dadurch wird das Aufschlussverhalten vieler Mikroorganismen beeinflusst. Eine Zugabe von Salzen z. B. verringert den Aufschlussgrad erheblich.

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Steffen Jahnke