Leuchtende Bakterien

Dr. Jiri Snaidr

Salmonellen und Listerien kommen in den meisten Lebensmitteln wie Milch, Milcherzeugnissen, Fische, Fisch- und Fleischprodukten vor. Bei dem Nachweis dieser Pathogenen ist die Zeitdauer der Analyse der kritische Faktor, da eine Verzögerung der Warenauslieferung der kostspielig ist und die Generationszeiten von Salmonellen und Listerien relativ kurz sind. Zwar liegt in der Regel die minimale Infektionsdosis bei Salmonellen bei 105. Bei immungeschwächten Personen, Kindern und älteren Menschen kann die minimale Anzahl an krankheitsauslösenden Bakterien aber auch nur wenige Zellen betragen. Eine Salmonellenvergiftung kann im Extremfall bereits nach sieben Stunden Inkubationszeit auftreten. Der konventionelle Nachweis von Salmonellen und Lis-terien nach § 35 des LMBG benötigt jedoch mindestens fünf Tage und anschließende Bestätigungstests. Diese Zeiträume sind zu lang, um ein sicheres und kostenreduzierendes Früherkennungssystem etablieren zu können.

Die als Vermicon Identification Technology (VIT) bezeichnete Gensondentechnologie der vermicon AG unterscheidet sich grundsätzlich von bekannten konventionellen Nachweismethoden. Im Unterschied zu konventionellen Verfahren muss nach der Voranreicherung nicht mehr selektiv angereichert werden. Ebenso müssen etwaige genetische Elemente nicht noch amplifiziert oder über eine komplexe Sandwichhybridisierung quasi gefischt werden. Die VIT-Gensondentechnologie bringt die Bakterien ganz einfach hochspezifisch zum Leuchten. Die leuchtenden Bakterien werden anschließend im Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen.

Die VIT-Gensondentechnologie nutzt die Tatsache aus, dass die Bakterien in den Milliarden von Jahren der Evolution einzigartige und unverwechselbare Signaturen in ihren Zellen erworben haben. Es gibt Marker, die typisch für eine einzelne Bakterienart sind, es gibt aber auch Bereiche, die typisch für eine ganze Bakteriengruppe oder gar für alle Bakterien sind. Diese einzelnen Bereiche können nun als Zielstellen für sogenannte Gensonden verwendet werden.

Gensonden sind extrem kleine Stücke der Erbsubstanz, der DNA. Diese werden in einem Speziallabor so konstruiert, dass sie, wenn sie in die Zelle eindringen, sich ganz genau auf die Zielstelle anheften. Man kann diese Gensonden sozusagen darauf programmieren, ganz bestimmte Bakterien in der Originalprobe zu erkennen. Die winzigen Gensonden liegen in milliardenfacher Ausführung in flüssiger Form vor und werden, nachdem sie mit einem Farbstoff gekoppelt wurden, einfach auf die Probe aufgebracht. Sie durchströmen dann sofort die Probe und dringen in die einzelnen Bakterienzellen ein. Finden sie nun in der Zelle die genaue Zielstelle, für die sie „programmiert“ wurden, so heften sie sich daran und lassen sich auch nach einem anschließenden Waschschritt nicht mehr davon ablösen. Wird die Originalprobe dann unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet, so fängt das Bakterium an zu leuchten (Abb. 1). Dieses Leuchten wird durch den an den Gensonden hängenden Farbstoff verursacht. Durch die Programmierung der Gensonden – zum Beispiel: färbe mir alle Bakterien rot, die der Bakteriengattung Salmonella zugehörig sind – können die leuchtenden Zellen schnell und unkompliziert direkt in der Probe erkannt werden. Durch das Einbringen von verschieden programmierten Gensonden können auch gleichzeitig unterschiedliche Bakterienpopulationen in der Originalprobe visualisiert werden. Die Vorteile des Verfahrens sind Schnelligkeit, Zuverlässigkeit und höchste Spezifität. Aber genau das ist das Besondere an VIT: eine hochpräzise molekularbiologische Methode mit der Einfachheit eines Aquarium-Schnelltests.

Wodurch ergibt sich nun die Schnelligkeit von VIT? Im Lebensmittelbereich muss beim konventionellen Nachweis nach einer nicht-selektiven Voranreicherung spezifisch auf unterschiedlichen Selektivmedien kultiviert werden. Bei der VIT-Gensondentechnologie wird direkt nach einer Voranreicherung, die ca. einen Tag benötigt, auf das Vorhandensein von pathogenen Bakterien getestet. Die Durchführung des VIT-Schnelltests benötigt insgesamt drei Stunden. Die Hands-On-Zeit beträgt für eine Analyse nur 15 Minuten und für zehn Analysen ca. 30 Minuten.

Um eine breite Anwendung der VIT-Technologie zu ermöglichen, wurden von vermicon Produkte entwickelt, die den Einsatz dieser molekularbiologischen Methode bei einfachster Handhabung und gleichzeitig höchster Robustheit sowie größter Präzision ermöglichen. Dabei basieren die unterschiedlichen VIT-Produkte auf dem gleichen Konzept. Die Anwendung verschiedener VIT-Analysekits erfordert daher keine Umstellung. Durch den Verzicht auf Pipetten wurde ein robustes und leicht handhabbares System geschaffen. Das gesamte System funktioniert auf der Basis von Tropfflaschen, die eine exakte Dosierung der aufeinander abgestimmten Lösungen garantieren. Somit können die Analysen sehr einfach durchgeführt werden. Das System ist zuverlässig und die Ergebnisse besitzen eine hohe Aussagekraft. Zur Analyse der Proben ist ein einfaches Epifluoreszenzmikroskop ausreichend.

VIT-Salmonella ermöglicht den schnellen und präzisen Nachweis von allen Bakterien der Gattung Salmonella. Ein Aliquot der ca. 24 Stunden alten Voranreicherung wird direkt mit dem Test VIT-Salmonella untersucht. Bei der anschließenden Auswertung unter dem Mikroskop leuchten Salmonellen in Rot. Dasselbe Prinzip wird bei VIT-Listeria zur Anwendung gebracht: Nach der Analyse eines Aliquots der ebenfalls ca. einen Tag alten Vorkultur mit dem VIT-Kit leuchten alle Zellen der Art Listeria monocytogenes in Rot. Zusätzlich leuchten alle Bakterien der Gattung Listeria in Grün (Abb.. 2 und 3). Auch hier ist das Auswerteprinzip wieder sehr einfach: Leuchten die untersuchten Bakterien in der Farbe Rot oder Grün auf, so sind sie dadurch sofort präzise identifiziert und visualisiert.

Vermicon wird auf der Biotechnica 2001, die vom 9. bis 11. Oktober in Hannover stattfindet, VIT-Salmonella und VIT-Listeria dem Fachpublikum präsentieren.

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