Schnelle Reinigung von Biomolekülen

Dr. Christian Martin, Dr. Ernst-Günter Graf

Die Mustang-Membranadsorber eröffnen neue Möglichkeiten bei der chromatographischen Reinigung von Biomolekülen. Herz der Membranadsorber sind Ionenaustausch-Membranen aus Polyethersulfon (PES), die bei der Herstellung mit geladenen, hydrophilen Monomeren chemisch modifiziert werden (Abb. 1).

Diese geladenen Monomere werden dabei kreuzvernetzt, um entweder Oberflächen mit Sulfonsäuregruppen (Mustang S) oder mit Quarternären Amingruppen (Mustang Q) zu erhalten. Die offene Porenstruktur der Mustang-Membranen mit ihrer homogenen Verteilung der chromatographisch wirksamen Gruppen führt dabei vor allem zu einer großen und frei zugänglichen Oberfläche für eine optimale Bindung von Biomolekülen bei gleichzeitig hohen Fließraten (Abb. 2). Durch eine Zwangsdurchströmung aller Porenkanäle entfällt die Diffusion als geschwindigkeitsbestimmender Schritt der Adsorption mit dem Resultat deutlich höherer Prozessgeschwindigkeiten. Sehr hohe dynamische Kapazitäten von 60 bis 80 mg/ml für Proteine und 25 mg/ml für Nucleinsäuren ermöglichen es, dass Biomoleküle auch bei bis zu 10fach höheren Fließraten effektiv gebunden und eluiert werden können. In allen Stufen einer Chromatographie können daher hohe Fließraten verwendet werden, ohne Kapazitätseinschränkungen, Verdünnungseffekte oder Auflösungsverluste befürchten zu müssen. Die 0,8-µm-Basismembran besitzt ferner eine gute mechanische Stabilität, die z. B. beim Cleaning in Place (CIP) oder beim Autoklavieren von Mustang-Elementen zum Tragen kommt.

Q- und S-Membranadsorber-Membranen kommen entweder als Mustang-Filterelemente bei der Negativ-Chromatographie zur Abscheidung von Kontaminanten oder als scheibenförmige Mustang-Module bei der Auflösungschromatographie zum Einsatz.

In biotechnologisch hergestellten pharmazeutischen Produkten sind typischerweise Nucleinsäuren wie zelluläre, plasmidale oder virale DNA und RNA als Kontaminanten enthalten. Um potenzielle Gefahren dieser Kontaminanten hinsichtlich ihrer pathogenen oder karzinogenen Wirkung zum Schutze von Patienten auszuschalten, werden von regulatorischen Behörden möglichst minimale Konzentrationen solcher biologischen Kontaminanten gefordert. Als maximale Grenzwerte werden dabei 100 pg Gesamt-DNA pro therapeutischer Dosis empfohlen.

Neben dem enzymatischen Verdau dieser Nucleinsäuren mit den damit verbundenen Limitierungen hinsichtlich Nucleasenaktivität und Zugänglichkeit zum Substrat, war die klassische Säulenchromatographie über gepackte Anionenaustauscherbeads bisher die Methode der Wahl zur Abscheidung von Nucleinsäuren. Um mit klassischen Säulenmaterialien einigermaßen akzeptable Kapazitäten zur Aufnahme von Biomolekülen zu erreichen, mussten allerdings niedrige Fließraten und somit erhöhter Zeitaufwand in Kauf genommen werden, um allen Biomolekülen ausreichend Zeit zur Diffusion an den Hauptanteil von freien Bindungsstellen im Inneren der Beads zu geben.

Die Mustang-Q-Membranadsorber-Filterelemente (Abb. 3, Mitte) enthalten 16 gefaltete Membranadsorberlagen und sind für die negative Chromatographie zur Abscheidung von Kontaminanten optimiert (z. B. Rest-DNA). Im Gegensatz zu Säulen, die gepackt und intensiv vorbehandelt werden müssen, können die autoklavierbaren Mustang-Q-Elemente nach kurzer Spülung mit Puffer unmittelbar eingesetzt werden. Mit scheibenförmigen 18-mm-Coins (Abb. 3, links) können Versuche im kleinen Maßstab durchgeführt und die Resultate rein flächenabhängig auf Prozessmaßstäbe skaliert werden. Die als Novasip-Komplettfilter sowie als Filterelemente erhältlichen Mustang-Q-Membranadsorber mit einem Bettvolumen von bis zu 300 ml pro 10-Zoll-Element empfehlen sich durch hohe Fließraten von 6,2 l/min pro bar bei gleichzeitig hoher Bindungskapazität von bis zu 7500 mg DNA. Durch die schnelle und volumenminimierte Verfahrensweise bei der Verwendung gebrauchsfertiger Mustang-Elemente zur Kontaminantenabscheidung durch Negativ-Chromatographie können erheblich Kosten für Puffer, Chemikalien und auch Arbeitsaufwand eingespart werden.

Die scheibenförmigen Mustang-Module sind mit jeweils 80 Membranlagen und einer Membranbetthöhe von ca. 1 cm (Abb. 3, rechts) gebrauchsfertig für die hochauflösende Chromatographie von Biomolekülen wie Proteinen, Nucleinsäuren, Oligonucleotiden oder auch Viren konfiguriert. Das aufwändige Packen und Vorbereiten des Trägermaterials mit einem entsprechenden Verbrauch an hochreinen Puffersubstanzen und Chemikalien entfällt somit. Mustang-Module können mit für die Chromatographie üblichen Chemikalien (z. B. NaOH/KCl) gereinigt und somit wiederverwendet werden. Die Reproduzierbarkeit und Trennungsgüte bleibt dabei bis über 175 Beladungs- und Reinigungszyklen unverändert gut.

Die funktionelle Einheit von Mustang-Modulen und den hydrodynamisch optimierten Edelstahlgehäusen erlaubt sogar eine Trennung von Biomolekülvarianten, die sich oft nur sehr geringfügig in ihrer Ladung unterscheiden, wie bei der:

• Separation der oxidierten Form des Lysozyms mit 99-prozentiger Reinheit von seiner nativen, nicht-oxidierten Form mit Mustang S-Modulen

• Separation der open circle von der supercoiled Form von Plasmiden mit Mustang-Q-Modulen (Abb. 4)

• Separation von synthetisierten Oligomeren von deren Deletionssequenzen (n-1, n-2, etc.) mit Mustang-Q-Modulen

Die scheibenförmigen Mustang-Module gibt es mit 10, 100 und 1000 ml Membranvolumen mit den jeweiligen passenden Edelstahlgehäusen für die Herstellung biotechnologischer Produkte unter cGMP-Bedingungen. Durch die rein flächenabhängige Kapazität und die damit verbundene einfache Skalierbarkeit tragen Mustang-Module wesentlich zur Reduzierung der Entwicklungszeit für chromatographische Prozesse bei. In Verbindung mit der umfangreichen Dokumentation, bestehend aus Bedienungsanleitung, Application Notes, Validation Guide, sowie Analysen- und P-Zertifikat wird die Durchführung und Validierung von chromatographischen Separationsschritten mit Mustang-Elementen und Modulen entscheidend erleichtert.

Halle 3, Stand E60

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